MEDIA KULTUR JARINGAN
MEDIA KULTUR JARINGAN
Media tanam adalah faktor penentu dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan bergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selainitu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, bergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.
Jenis dan komposisi media sangat mempengaruhi besarnya daya tahan eksplan untuk hidup pada media tersebut, sedangkan zat pengatur tumbuh Auksin dan Sitokinin endogen yang terdapat pada eksplan berpengaruh terhadap besarnya penyerapan zat makanan yang tersedia dalam media kultur sehingga eksplan dapat bertahan hidup lebih lama
Bila pertumbuhan eksplan baik maka dapat meningkatkan daya tahan hidup eksplan. Media dalam kultur jaringan tanaman umumnya terdiri dari komponen-komponen sebagai berikut: hara makro, hara mikro, vitamin, asam amino atau suplemen nitrogen lainnya, gula, bahan organik komplek, bahan pemadat (agar), dan zat pengatur tumbuh (hormon).
Beberapa formulasi media yang sudah umum digunakan dalam banyak pekerjaan kultur jaringan antara lain adalah media White, Murashige & Skoog (MS), Gamborg et al. (B5), , Nitch & Nitch, dll. Media MS, dan B5 merupakan media yang kaya garam-garam makro.
Berikut penjelasan dari masing-masing komposisi media tersebut :
Menurut George dan Sherington (1984) ada media dasar yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya, antara lain:
Medium dasar Murashige dan Skoog (MS), digunakan hamper pada semua macam tanaman terutama herbaceous. Media ini memiliki konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+.
Medium dasar B5 atau Gamborg, digunakan untuk kultur suspense sel kedelai, alfafa dan legume lain.
1) Media dasar white, digunakan untuk kultur akar. Media ini merupakan media dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah.
2) Media Vacint Went (VW), digunakan khusus untuk medium anggrek.
3) Media dasar Nitsch dan Nitsch, digunakan untuk kultur tepung sari
(Pollen) dan kultur sel.
4) Media dasar Schenk dan Hildebrandt, digunakan untuk tanaman yang berkayu.
5) Media dasar Woody Plant Medium (WMP), digunakan untuk tanaman yang berkayu.
6) Media dasar N6, digunakan untuk tanaman serealia terutama padi, dan lain-lain.
Media MS paling banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur, merupakan perbaikan komposisi media Skoog, Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain.
Prosedur Kerja
a) Pembuatan Larutan Stok
1) Larutan stok A merupakan larutan hara makro, dibuat 10 kali dilarutkan sampai 1000 ml aquades.
2) Larutan stok B merupakan larutan hara mikro, dibuat 1000 kali dilarutkan dalam 100 ml aquades.
3) Larutan stok C merupakan campuran FeSO4.7H2O dan Na2-EDTA, dibuat 100 kali dan dilarutkan kedalam 200ml aquades.
4) Larutkan stok D merupakan larutan vitamin kecuali mio-inositol, dibuat 100 kali dalam 200 ml aquades.
5) Larutan stok E merupakan larutan mio-inositol, dibuat 100 kali dan dilarutkan ke dalam 100 ml aquades.
6) Larutan stok F merupakan larutan ZPT, dibuat 100 kali dilarutkan kedalam 500 ml aquades.
b) Pembuatan Media MS
1) Siapkan Aquades sebanyak 500 ml di dalam erlenmeyer ukuran 1000 ml. masukkan larutan stok A, B, C, D, E dan F kedalam erlenmeyer sesuai dengnan yang dibutuhkan. Untuk pembuatan 1 liter medium, maka stok A diperlukan sebanyak 100 ml, stok B 0,1 ml, stok C 2 ml, stok D 2 ml, stok E 1 ml, dan stok F 5 ml. Semua larutan dicampur sambil digoyangkan wadahnya agar semua bahan kimia tersebut larut.
2) Timbang sukrosa sebanyak 30 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer (pada point 1) sambil diaduk sampai homogen.
3) Tambahkan aquades sampai volumenya 1000 ml.
4) pH larutan diukur dengan menggunakan pH meter elektrik atau kertas lakmus, pH yang diutuhkan sekitar 5,7-5,8. Jika terlalu asam maka larutan ditambahkan KOH atau NaOH 1 M dan jika terlalu basa dapat ditambahkan HCl 1 M. Penambahan bahan tersebut dilakukan hingga pH yang diinginkan tercapai.
5) Tambahkan agar-agar ke dalam larutan tersebut sebanyak 7 gr, lalu dipanaskan di atas kompor sampai mendidih sambil di aduk-aduk.
6) Tuangkan media ke dalam botol kultur sekitar 20 ml per botol tergantung ukuran botol.
7) Botol ditutup dengan alumunium foil kemudian direkatkan menggunakan seal.
Gambar 25. Pembuatan Media Tanam Kultur Jaringan
c) Vitamin
Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kulturjaringan tanaman, adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin) dan pyridoxine (vitamin B6). Thiamine merupakan vitamin yang esensial dalam kultur tanaman. Myoinositol yang kadang kadang juga disebut mesoinositol atau inositol, bukanlah vitamin dalam kebutuhan fisiologis hewan. Penambahan myoinositol kedalam media, memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis. Oleh karena itu sering dipandang sebagai golongan vitamin untuk tanaman. Menurut George dan Sherrington, kemungkinan, peranannya melalui keikutsertaannya dalam lintasan biosintesa.
d) Zat Pengatur Tumbuh
Dalam kultur jaringan, dua golongan zat pengatur tumbuh yang sangat penting adalah sitokinin dan auksin. Zat pengatur tumbuh ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan, danorgan. lnteraksi dan perimbangan antara zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam media dan yang diproduksi oleh sel secara endogen, menentukan arah perkembangan suatu kultur. Penambahan auksin atau sitokinin eksogen, mengubah level zat pengatur tumbuh endogen sel. Level zat pengatur tumbuh endogen ini kemudian, merupakan trigering factor untuk proses-proses yang tumbuh dan morfo-genesis. Selain auksin dan sitokinin, giberelin dan persenyawaan-persenyawaan lain juga ditambahkan dalam kasus-kasus tertentu.
1) Auksin
Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk pertumbuhan kalus, suspensi seldan organ. Pemilihan jenis auksin dan, konsentrasi, tergantung dari:
o tipe petumbuhan yang dikehendaki
o level auksin endogen
o kemampuan jaringan mensintesa auksin
o golongan zat tumbuh lain yang ditambahkan.
2) Golongan Sitokinin
Golongan sitokinin adalah turunan dari adenine. Golongan ini sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis
o Sitokinin yang biasa digunakan dalam kultur jaringan :
o Kinetin, (6-furfuryl amino purine), berat molekul 215.25.
o Zeatin, (4-hydroxyl 73-methyltrans- 2-butenyl amino purine), berat molekul 219.25
o 2iP (N6-2-isopentanyl adenine, atau 6-(t,t-dimetylallyl amino purine), berat molekul 203.21.
o BAP/BA (6-benzyl amino purine/6-benzyl adenine), berat molekul 225.26
o Thidiazurin urea, berat molekul 220.25
3) Giberelin
Penggunaan giberelin dalam kultur jaringan, tanaman, kadang-kadang membantu morfogenesis. Tetapi dalam kultur kalus dimana pertumbuhan sudah cepat hanya dengan auksin dan sitokinin, maka penambahan giberelin sering menghambat. Pada umumnya giberelin terutama GA3 menghambat perakaran. Pengaruh positif giberelin ditemukan bit gula, dimana GA3 merangsang pembentukan pucuk dari potongan inflorescence. Pertumbuhan kentang juga baik bila diberikan 0.01-0.10mg/1 GA3 dikombinasikan dengan0.5-5.0 mg/1 kinetin. Beratmolekul GA3 346.38.
4) Sumber energi/ Karbohidrat
Didalam kultur jaringan, bahan tanaman yang digunakan merupakan bagian kecil dari tanaman dan tidak merupakan suatu sistim yang lengkap. Dengan demikian, banyak bahan-bahan organik harus ditambahkan kedalam media untuk mendukung pertumbuhan yang optimal. Karbohidrat terutama gula, merupakan komponen yang selalu ada dalam media tumbuh, kecuali dalam media untuk tujuan yang sangat spesifik. Gula putih yang biasa digunakan untuk keperluan sehari-hari cukup memenuhi syarat untuk mendukung pertumbuhan kultur.
a) Bahan Pemadat
Bahan pemadat yang paling banyak digunakan agar, keuntungan dari pemakaian agar adalah:
Agar membeku pada suhu < 45oC dan mencair pada temperatur 100oC, sehingga dalam kisaran temperature kultur agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil
Tidak dicerna oleh enzim tanaman
Tidak bereaksi dengan persenyawaan penyusun media.
Agar adalah campuran polisakharida yang diperoleh dari beberapa species algae. Kekerasan media pada umumnya meningkat secara linier pada pertambahan konsentrasi agar. Kekerasan media juga dipengaruhi oleh :
Jenis agar yang dipakai.
pH media
5) Derajat Keasaman Media (pH Media)
Faktor penting lain yang juga perlu mendapat perhatian, adalah pH yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor:
Kelarutan dari garam-garam penyusun media
Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain
Efisiensi pembekuan agar.
Sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5.5 - 5.8. Tanaman Ericaceae seperti Rhododendron ditemukan tumbuh lebih baik dalam media 4.5. Pengaturan pH, biasa dilakukan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCl pada waktu semua komponen sudah dicampur, beberapa saat sebelum disterilkan dengan autoclave.
Prosedur Kerja
a) Pembuatan Larutan Stok
1) Larutan stok A merupakan larutan hara makro, dibuat 10 kali dilarutkan sampai 1000 ml aquades.
2) Larutan stok B merupakan larutan hara mikro, dibuat 1000 kali dilarutkan dalam 100 ml aquades.
3) Larutan stok C merupakan campuran FeSO4.7H2O dan Na2-EDTA, dibuat 100 kali dan dilarutkan kedalam 200ml aquades.
4) Larutkan stok D merupakan larutan vitamin kecuali mio-inositol, dibuat 100 kali dalam 200 ml aquades.
5) Larutan stok E merupakan larutan mio-inositol, dibuat 100 kali dan dilarutkan ke dalam 100 ml aquades.
6) Larutan stok F merupakan larutan ZPT, dibuat 100 kali dilarutkan kedalam 500 ml aquades.
b) Pembuatan Media MS
1) Siapkan Aquades sebanyak 500 ml di dalam erlenmeyer ukuran 1000 ml. masukkan larutan stok A, B, C, D, E dan F kedalam erlenmeyer sesuai dengnan yang dibutuhkan. Untuk pembuatan 1 liter medium, maka stok A diperlukan sebanyak 100 ml, stok B 0,1 ml, stok C 2 ml, stok D 2 ml, stok E 1 ml, dan stok F 5 ml. Semua larutan dicampur sambil digoyangkan wadahnya agar semua bahan kimia tersebut larut.
2) Timbang sukrosa sebanyak 30 gr dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer (pada point 1) sambil diaduk sampai homogen.
3) Tambahkan aquades sampai volumenya 1000 ml.
4) pH larutan diukur dengan menggunakan pH meter elektrik atau kertas lakmus, pH yang diutuhkan sekitar 5,7-5,8. Jika terlalu asam maka larutan ditambahkan KOH atau NaOH 1 M dan jika terlalu basa dapat ditambahkan HCl 1 M. Penambahan bahan tersebut dilakukan hingga pH yang diinginkan tercapai.
5) Tambahkan agar-agar ke dalam larutan tersebut sebanyak 7 gr, lalu dipanaskan di atas kompor sampai mendidih sambil di aduk-aduk.
6) Tuangkan media ke dalam botol kultur sekitar 20 ml per botol tergantung ukuran botol.
7) Botol ditutup dengan alumunium foil kemudian direkatkan menggunakan seal.
Gambar 25. Pembuatan Media Tanam Kultur Jaringan
c) Vitamin
Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kulturjaringan tanaman, adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin) dan pyridoxine (vitamin B6). Thiamine merupakan vitamin yang esensial dalam kultur tanaman. Myoinositol yang kadang kadang juga disebut mesoinositol atau inositol, bukanlah vitamin dalam kebutuhan fisiologis hewan. Penambahan myoinositol kedalam media, memperbaiki pertumbuhan dan morfogenesis. Oleh karena itu sering dipandang sebagai golongan vitamin untuk tanaman. Menurut George dan Sherrington, kemungkinan, peranannya melalui keikutsertaannya dalam lintasan biosintesa.
d) Zat Pengatur Tumbuh
Dalam kultur jaringan, dua golongan zat pengatur tumbuh yang sangat penting adalah sitokinin dan auksin. Zat pengatur tumbuh ini mempengaruhi pertumbuhan dan morfogenesis dalam kultur sel, jaringan, danorgan. lnteraksi dan perimbangan antara zat pengatur tumbuh yang diberikan dalam media dan yang diproduksi oleh sel secara endogen, menentukan arah perkembangan suatu kultur. Penambahan auksin atau sitokinin eksogen, mengubah level zat pengatur tumbuh endogen sel. Level zat pengatur tumbuh endogen ini kemudian, merupakan trigering factor untuk proses-proses yang tumbuh dan morfo-genesis. Selain auksin dan sitokinin, giberelin dan persenyawaan-persenyawaan lain juga ditambahkan dalam kasus-kasus tertentu.
1) Auksin
Auksin digunakan secara luas dalam kultur jaringan untuk pertumbuhan kalus, suspensi seldan organ. Pemilihan jenis auksin dan, konsentrasi, tergantung dari:
o tipe petumbuhan yang dikehendaki
o level auksin endogen
o kemampuan jaringan mensintesa auksin
o golongan zat tumbuh lain yang ditambahkan.
2) Golongan Sitokinin
Golongan sitokinin adalah turunan dari adenine. Golongan ini sangat penting dalam pengaturan pembelahan sel dan morfogenesis
o Sitokinin yang biasa digunakan dalam kultur jaringan :
o Kinetin, (6-furfuryl amino purine), berat molekul 215.25.
o Zeatin, (4-hydroxyl 73-methyltrans- 2-butenyl amino purine), berat molekul 219.25
o 2iP (N6-2-isopentanyl adenine, atau 6-(t,t-dimetylallyl amino purine), berat molekul 203.21.
o BAP/BA (6-benzyl amino purine/6-benzyl adenine), berat molekul 225.26
o Thidiazurin urea, berat molekul 220.25
3) Giberelin
Penggunaan giberelin dalam kultur jaringan, tanaman, kadang-kadang membantu morfogenesis. Tetapi dalam kultur kalus dimana pertumbuhan sudah cepat hanya dengan auksin dan sitokinin, maka penambahan giberelin sering menghambat. Pada umumnya giberelin terutama GA3 menghambat perakaran. Pengaruh positif giberelin ditemukan bit gula, dimana GA3 merangsang pembentukan pucuk dari potongan inflorescence. Pertumbuhan kentang juga baik bila diberikan 0.01-0.10mg/1 GA3 dikombinasikan dengan0.5-5.0 mg/1 kinetin. Beratmolekul GA3 346.38.
4) Sumber energi/ Karbohidrat
Didalam kultur jaringan, bahan tanaman yang digunakan merupakan bagian kecil dari tanaman dan tidak merupakan suatu sistim yang lengkap. Dengan demikian, banyak bahan-bahan organik harus ditambahkan kedalam media untuk mendukung pertumbuhan yang optimal. Karbohidrat terutama gula, merupakan komponen yang selalu ada dalam media tumbuh, kecuali dalam media untuk tujuan yang sangat spesifik. Gula putih yang biasa digunakan untuk keperluan sehari-hari cukup memenuhi syarat untuk mendukung pertumbuhan kultur.
a) Bahan Pemadat
Bahan pemadat yang paling banyak digunakan agar, keuntungan dari pemakaian agar adalah:
Agar membeku pada suhu < 45oC dan mencair pada temperatur 100oC, sehingga dalam kisaran temperature kultur agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil
Tidak dicerna oleh enzim tanaman
Tidak bereaksi dengan persenyawaan penyusun media.
Agar adalah campuran polisakharida yang diperoleh dari beberapa species algae. Kekerasan media pada umumnya meningkat secara linier pada pertambahan konsentrasi agar. Kekerasan media juga dipengaruhi oleh :
Jenis agar yang dipakai.
pH media
5) Derajat Keasaman Media (pH Media)
Faktor penting lain yang juga perlu mendapat perhatian, adalah pH yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor:
Kelarutan dari garam-garam penyusun media
Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain
Efisiensi pembekuan agar.
Sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5.5 - 5.8. Tanaman Ericaceae seperti Rhododendron ditemukan tumbuh lebih baik dalam media 4.5. Pengaturan pH, biasa dilakukan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCl pada waktu semua komponen sudah dicampur, beberapa saat sebelum disterilkan dengan autoclave.
Komentar
Posting Komentar