MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN
MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN
A. Tujuan
Setelah mempelajari materi dan melakukan praktik dengan cermat, teliti dan hati-hati peserta pelatihan mampu membuat larutan stok dan media kultur jaringan tanaman dengan komposisi yang sesuai, steril dan memiliki kepadatan yang cukup.
B. Indikator Pencapaian Kompetensi
Melalui kegiatan pengamatan, diskusi, dan pengumpulan informasi bapak/ ibu dapat:
1. Menjelaskan komponen-komponen dalam media kultur jaringan dengan benar
2. Menjelaskan komposisi dasar media kultur jaringan dengan benar
3. Membuat larutan stok
4. Membuat media kultur
C. Uraian Materi
1. Komponen-komponen media kultur jaringan
Media kultur jaringan tanaman merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan dalam pembiakan tanaman secara kultur jaringan, oleh karena itu dalam modul ini akan dibahas tentang persiapan media khususnya cara pembuatan larutan stok. Pekerjaan pembuatan media dilakukan di ruang persiapan, yang pada prinsipnya dilakukan dengan cara melarutkan semua komponen media dalam air sesuai dengan konsentrasi pada formulasi yang dikehendaki.
Komponen dalam media kultur jaringan meliputi:
a. Unsur hara makro yang meliputi nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg), dan sulfur (S).
b. Unsur mikro yang meliputi boron (B), cobalt (Co), tembaga (Cu), Iodium (I), besi (Fe), mangan (Mn), molybdenum (Mo), dan seng (Zn).
c. Vitamin (vitamin B1) dan Myo-inositol.Untuk beberapa formula media ada juga yang ditambahkan niasin dan piridoksin (B6).
d. Gula (sukrosa) berfungsi sebagai sumber energi.
e. Zat pengatur tumbuh berfungsi untuk merangsang dan mengontrol pertumbuhan.
f. Agar-agar berfungsi sebagai pemadat media.
g. Arang aktif berfungsi sebagai penyerap senyawa racun (jika diperlukan).
h. Air suling (aquades) berfungsi sebagai pelarut.
2. Komposisi dasar media kultur jaringan
Terdapat banyak formula/resep komposisi dasar media tanam kultur jaringan yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya, antara lain:
a. Murashige dan Skoog (MS), memiliki kisaran pemakaian yang paling luas.
b. Gamborg atau B-5, cocok untuk kultur suspensi sel kedelai dan legume.
c. Vacin dan Went (VW), cocok digunakan untuk media kultur jaringan anggrek
d. Nitsch dan Nitsch (NN), cocok digunakan untuk media kultur tepung sari dan kultur sel.
e. Schenk dan Hildebrandt (SH) cocok digunakan untuk media tanaman dikotil.
f. Woody Plant Medium (WPM) cocok digunakan untuk media tanaman berkayu.
Detail komposisi dasar media kultur jaringan diatas terdapat pada Tabel1.
Tabel 1. Formulasi media kultur jaringan (NN, MS, B5)
NO
|
SENYAWA KIMIA
|
NN
mg/liter
|
MS
mg/liter
|
B5
mg/liter
|
1
|
(NH4)2SO4
|
-
|
-
|
134
|
2
|
NH4NO3
|
720
|
1650
|
-
|
3
|
KNO3
|
950
|
1900
|
2500
|
4
|
CaCl2.2H2O
|
166
|
440
|
150
|
7
|
MgSO4.7H2O
|
185
|
370
|
250
|
6
|
KH2PO4
|
68
|
170
|
-
|
7
|
NaH2PO4.H2O
|
-
|
-
|
150
|
8
|
FeSO4.7H2O
|
27,8
|
27,8
|
27,8
|
9
|
Na2EDTA
|
37,3
|
37,3
|
37,3
|
10
|
MnSO4.H2O
|
18,9
|
16,9
|
10,0
|
11
|
ZnSO4.7H2O
|
10,0
|
8,6
|
2,0
|
12
|
H3BO3
|
10,0
|
6,2
|
3,0
|
13
|
KI
|
-
|
0,83
|
0,75
|
14
|
Na2MoO4.2H2O
|
0,25
|
0,25
|
0,25
|
15
|
CuSO4.5H2O
|
0,025
|
0,025
|
0,025
|
16
|
CoCl2.6H2O
|
-
|
0,025
|
0,025
|
17
|
Biotin
|
0,05
|
-
|
-
|
18
|
Myo-inositol
|
100
|
100
|
100
|
19
|
Niacin
|
5,0
|
0,5
|
1,0
|
20
|
Pyridoxin-HCl
|
0,5
|
0,5
|
1,0
|
21
|
Thiamine-HCl
|
0,5
|
0,1
|
10,0
|
22
|
Glycine
|
2,0
|
2,0
|
-
|
23
|
Folic acid
|
0,5
|
-
|
-
|
24
|
Sucrose
|
20.000
|
30.000
|
20.000
|
3. Pembuatan larutan stok
Pekerjaan pembuatan media dilakukan di ruang persiapan, yang pada prinsipnya dilakukan dengan cara melarutkan semua komponen media dalam air sesuai dengan konsentrasi pada formulasi yang dikehendaki. Akan tetapi penimbangan bahan kimia satu per satu secara berkali-kali pada setiap pembuatan media menjadi tidak praktis, disamping itu akan terjadi kesulitan dalam penimbangan bila bahan yang ditimbang hanya diperlukan dalam berat/ jumlah yang terlalu sedikit. Untuk mengatasi permasalahan ini maka perlu dibuat larutan stok dengan konsentrasi lebih pekat, sehingga bila akan membuat media cukup mengambil larutan stok dengan volume sesuai dengan perhitungan konsentrasi yang dikehendaki, dengan demikian pembuatan media menjadi lebih praktis dan tidak menyita waktu penimbangan yang terlalu lama.
Larutan stok adalah larutan yang berisi satu atau lebih komponen media yang konsentrasinya lebih tinggi daripada konsentrasi komponen tersebut dalam formulasi media yang akan dibuat. Larutan stok dapat dibuat dengan konsentrasi 10 kali hingga 100 kali lipat lebih pekat. Pembuatan media dapat dilakukan dengan cara mengambil sejumlah larutan stok sehingga konsentrasinya sesuai dengan yang terdapat dalam formulasi media yang dikehendaki.
Dalam membuat larutan stok, hal yang penting untuk diperhatikan adalah penyatuan beberapa komponen media sekaligus dalam satu larutan supaya memperhatikan kecocokan dan kestabilan sifat kimianya, disamping itu dalam larutan stok tidak boleh terjadi endapan.
Umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan dimana media dasar berisi komposisi dasar kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro & mikro), sumber energi, dan vitamin.
Untuk membuat media dasar MS (Murashige & Skoog) dengan formulasi seperti pada tabel tersebut maka larutan stok dapat dikelompokkan menjadi stok hara makro, stok hara mikro, stok besi, stok vitamin, stok ZPT/ hormon.
Kebutuhan bahan yang diperlukan untuk membuat larutan stok dihitung berdasarkan kelipatan konsentrasi yang terdapat pada formulasi media yang diinginkan. Berikut adalah contoh cara perhitungan kebutuhan stok untuk senyawa NH4NO3 :
Kebutuhan senyawa NH4NO3 untuk media MS : 1.650 mg/liter.
Untuk membuat stok NH4NO3 10x konsentrasi, maka diperlukan 16.500 mg NH4NO3 dilarutkan dalam 1000 ml aquades.
Bila telah tersedia stok NH4NO3 dengan konsentrasi 16.500 mg/liter, maka jumlah stok NH4NO3 yang diperlukan untuk membuat 1 liter media MS dapat dihitung dengan rumus berikut:
V1 x N1 = V2 x N2
V1 : volume media yang akan dibuat
N1 : konsentrasi NH4NO3 yang diperlukan dalam media
V2 : volume larutan stok yang diperlukan untuk membuat 1 liter media
N2 : konsentrasi NH4NO3 dalam larutan stok
V2 = V1 x N1
N2
= 1000 ml x 1650 mg/liter
16.500 mg/liter
= 100 ml
Jadi untuk membuat 1 liter media MS, volume stok NH4NO3 yang diperlukan adalah 100 ml. Cara perhitungan untuk jenis stok yang lain dapat dianalogikan.
Berikut adalah tabel kebutuhan senyawa kimia pada setiap jenis larutan stok yang diperlukan untuk membuat media dasar MS (Murashige & Skoog).
Tabel 2. Kebutuhan larutan stok untuk media MS
NAMA STOK
|
SENYAWA DALAM STOK
|
KONSENTRASI DALAM MEDIA MS (mg/liter)
|
KONSENTRASI DALAM STOK
(mg/liter)
|
VOL STOK YANG DIPERLUKAN DALAM 1 LT MEDIA MS (ml)
|
A (10x)
|
NH4NO3
|
1.650
|
16.500
|
100
|
B (10X)
|
KNO3
|
1.900
|
19.000
|
100
|
C (10X)
|
CaCl2.2H2O
|
440
|
4.400
|
100
|
D (10X)
|
MgSO4.7H2O
|
370
|
3.700
|
100
|
KH2PO4
|
170
|
1.700
| ||
E (100X)
|
FeSO4.7H2O
|
27,8
|
2.780
|
10
|
Na2EDTA
|
37,3
|
3.730
| ||
F (100x)
|
MnSO4.H2O
|
16,9
|
1.690
|
10
|
ZnSO4.7H2O
|
8,6
|
860
| ||
H3BO3
|
6,2
|
620
| ||
KI
|
0,83
|
83
| ||
Na2MoO4.2H2O
|
0,25
|
25
| ||
CuSO4.5H2O
|
0,025
|
2,5
| ||
CoCl2.6H2O
|
0,025
|
2,5
| ||
Vitamin (100x)
|
Thiamine-HCl
|
1,0
|
10 mg/100ml
|
10
|
Nicotinic acid
|
0,5
|
5 mg/100ml
| ||
Pyridoxin-HCl
|
0,5
|
5 mg/100ml
| ||
Glycine
|
2,0
|
20 mg/100ml
|
Keterangan: Bila volume larutan stok dan media yang akan dibuat ada perubahan, maka perhitungan tinggal dikonversikan saja.
Selain perhitungan kelipatan konsentrasi, maka pembuatan larutan stok juga harus mempertimbangkan kebutuhan media dan masa kadaluwarsa larutan stok. Misalnya masa kadaluwarsa stok adalah 1 bulan, sedangkan untuk membuat media dalam 1 bulan menghabiskan stok masing-masing sebanyak 1 liter dengan kelipatan konsentrasi 100x, maka larutan stok yang dibuat dalam 1 bulan masing-masing sebanyak 1 liter dengan konsentrasi 100 x. Dengan demikian larutan stok yang dibuat tidak pernah mubadzir karena kadaluwarsa.
Larutan stok merupakan bahan yang mudah terkontaminasi sehingga setelah selesai dibuat harus segera ditutup rapat dan disimpan di lemari es. Khusus untuk stok besi harus disimpan dalam botol yang gelap atau kalau botolnya bening dapat dibungkus dengan alumunium foil. Stok besi ini bila terkena sinar matahari akan mudah ditumbuhi plankton sehingga tidak dapat digunakan lagi karena selain telah terkontaminasi maka efektifitasnya juga telah berkurang. Berikut adalah hal-hal yang penting untuk diperhatikan dalam membuat larutan stok:
a. Larutan stok sebaiknya disimpan tidak lebih dari dua bulan. Stok vitamin dan ZPT lebih baik kalau digunakan dalam keadaan segar atau kurang dari dua minggu setelah dibuat. Oleh karena itu berapa volume larutan stok yang akan dibuat, sebaiknya ditentukan dahulu berapa kebutuhan media dan kapan media akan dibuat.
b. Larutan stok yang telah mengalami pengendapan dan yang sudah ditumbuhi mikroorganisme tidak boleh digunakan lagi.
c. Semua peralatan gelas untuk membuat stok dan media harus dibilas dengan aquades dulu baik sebelum maupun setelah digunakan.
d. Kebutuhan larutan stok untuk membuat media dapat digunakan rumus V1 x N1 = V2 x N2.
Untuk memudahkan pada saat pembuatan media kultur jaringan maka larutan stok untuk media MS dapat dikelompokkan menjadi beberapa kelompok berikut:
a. Larutan stok A
Berdasarkan komposisi nutrisi yang diperlukan maka kebutuhan HN4NO3 untuk larutan stok A sebanyak 1 liter untuk 50 x konsentrasi adalah 83,50 gram NH4 NO3/ 1 liter aquades.
b. Larutan stok B
Berdasarkan komposisi nutrisi yang diperlukan maka kebutuhan KNO3 untuk larutan stok B sebanyak 1 liter untuk 50 x konsentrasi adalah 95 gram KNO3/ 1 liter aquades.
c. Larutan stok C
Berdasarkan komposisi nutrisi yang diperlukan maka kebutuhan CaCl2.Ha2O untuk larutan stok C sebanyak 1 liter untuk 100 x konsentrasi adalah 44 gram CaCl2.Ha2O/ liter aquades.
d. Larutan stok D
Berdasarkan komposisi nutrisi yang diperlukan maka kebutuhan untuk larutan stok D sebanyak 1 liter untuk 100 x konsentrasi adalah 37 gram MgSO4.H2O dan 17 gram KH2PO4 dilarutkan dalam 1 liter aquades. Prosedur melarutkan kedua jenis bahan ini disesuaikan dengan ketentuan.
e. Larutan stok E
Berdasarkan komposisi nutrisi yang diperlukan maka kebutuhan untuk larutan stok E sebanyak 1 liter untuk 200 x konsentrasi adalah 5,57 gram FeSO4.7H2O dan 7,45 gram Na2EDTA dilarutkan dalam 1 liter aquades. Prosedur melarutkan kedua jenis bahan ini disesuaikan dengan ketentuan.
f. Larutan stok F (hara mikro)
Larutan stok hara mikro biasanya dibuat dengan kepekatan 200x konsentrasi. Bahan untuk membuat 1 liter stok mikro adalah sebagai berikut:
1) MnSO4.H2O : 3380,0 mg
2) ZnSO4.7H2O : 1720,0 mg
3) H3BO3 : 1240,0 mg
4) KI : 166,0 mg
5) Na2MoO4.2H2O : 50,0 mg
6) CoCl2.6H2O : 5,0 mg
7) CuSO4.5H2O : 5,0 mg
g. Larutan stok vitamin
Larutan stok vitamin dibuat dengan kepekatan 100x konsentrasi. Bahan untuk membuat 1 liter stok mikro adalah sebagai berikut:
1) Thiamine HCl : 10,0 mg
2) Nicotinic acid : 50,0 mg
3) Pyridoxin HCl : 50,0 mg
4) Glycine : 200,0 mg
4. Pembuatan media kultur jaringan
Sebelum media tanam dibuat, sebaiknya beberapa zat komponen media perlu ditimbang seperti myo inositol, agar-agar dan gula serta alat dan bahan yang diperlukan sudah disiapkan. Semua komponen media baik dalam bentuk larutan stok maupun bahan yang ditimbang dimasukkan satu demi satu ke dalam gelas piala, volume akhir dibuat menjadi 1 liter dengan menambahkan aquades, pengukuran volume akhir dilakukan dengan menggunakan labu ukur. Larutan diaduk sampai homogen kemudian pHnya diukur, apabila pHnya lebih tinggi dari pH yang diinginkan larutan ditetesi dengan HCl sedangkan apabila lebih rendah ditetesi KOH. Setelah pH larutan diukur, pemadat media (agar-agar 7 g/l atau gelrite 2 g/l) ditambahkan, media dimasak sampai mendidih untuk melarutkan pemadat medianya. Media dimasukkan ke dalam botol-botol kultur dan ditutup dengan plastik atau aluminum foil, media dalam botol disterilisasi menggunakan autoklaf pada tekanan 1,1-1,5 kg/cm2 dengan suhu 121°C selama 15-30 menit tergantung spesifikasi autoklaf. Setelah dingin, media sebaiknya disimpan di ruang ber-AC (suhu 24-26°C) selama 3 hari sebelum digunakan dengan tujuan untuk melihat kesterilan media yang ditandai dengan tidak adanya kontaminasi dalam media tersebut.
a. Pembuatan media MS
Berdasarkan kepekatan larutan stok yang telah dibuat di atas maka untuk membuat media MS sebanyak 1 liter tidak harus menimbang bahan semuanya tetapi cukup mengambil dari larutan stok yang telah tersedia seperti berikut ini.
1) Larutkan 30 gram gula pasir kedalam ± 700 ml aquades.
2) Tambahkan 20 ml larutan stok A dan 20 ml larutan stok B.
3) Tambahkan 10 ml larutan stok C dan 10 ml larutan stok D.
4) Tambahkan 5 ml larutan stok E dan 5 ml larutan stok F.
5) Tambahkan 1 ml stok vitamin.
6) Tambahkan 100 mg myo-inositol (Myo inositol tidak perlu dibuat larutan stoknya tapi langsung ditimbang saat pembuatan media)
7) Tambahkan zat pengatur tumbuh sesuai kebutuhan.
8) Tambahkan aquades hingga volume mendekati 1000 ml, ukur pH media antara 5,6 sd 5,8.
9) Tepatkan volume hingga 1000 ml.
10) Tambahkan ± 8 gram agar-agar.
11) Panaskan sambil diaduk hingga agar-agar larut.
12) Angkat media dari pemanas ketika hampir mendidih.
13) Tuangkan ke dalam botol kultur ± 25 ml.
14) Sterilkan dalam autoclave pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit.
b. Pembuatan media anggrek
1) Media tabur biji anggrek
Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat media tabur biji anggrek adalah:
· Pupuk growmore/ gaviota netral (21:21:21) sebanyak 1,5 gram
· Air kelapa 150 ml
· Gula putih/ gula pasir 20 gram
· Agar-agar (batangan 1 buah atau agar bubuk swallow 7-8 gram)
· Tomat diblender 50 gram
· Thiamine 1 ml
Cara membuat media tabur biji anggrek adalah sebagai berikut:
a) Bahan-bahan dicampur menjadi satu dan ditambah aquades sedikit demi sedikit sambil diaduk hingga volume 1 liter
b) Campuran bahan direbus hingga hampir mendidih
c) pH diukur = 5,1. Bila kurang ditambah larutan NaOH 1 N setetes demi setetes hingga pH = 5,1. Bila terlalu tinggi ditambah larutan HCl 1 N setetes demi setetes hingga pH = 5,1.
d) Media dimasukkan dalam botol dan disterilkan dalam autoclave pada suhu 1200 C selama 30 menit
2) Media sapih anggrek
Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat media sapih anggrek adalah:
· Pupuk growmore/ gaviota netral (21:21:21) sebanyak 1,5 gram
· Air kelapa 150 ml
· Gula putih/ gula pasir 20 gram
· Agar-agar (batangan 1 buah atau agar bubuk swallow 7-8 gram)
· Pisang raja diblender 50 gram
· Charcoal/ arang aktif 1 gram
· NAA 1 ml
· Thiamine 1 ml
Adapun cara membuat media sapih anggrek sama persis dengan cara membuat media tabur biji anggrek.
Media kultur jaringan yang telah disterilkan harus diinkubasikan lebih dahulu selama 3 sampai 4 hari sebelum digunakan atau ditanami. Tujuan dari inkubasi tersebut adalah untuk memastikan bahwa media sudah betul-betul steril. Jika media tidak steril maka setelah 4 sampai 5 hari di permukaan media akan tumbuh mikroorganisme, dapat berupa jamur atau bakteri.
Media kultur yang baik untuk ditanami setelah 4 sampai 5 hari diinkubasikan memiliki ciri-ciri bersih tidak terkontaminasi mikroorganisme dan memiliki tingkat kepadatan agar-agar yang sedang (tidak terlalu padat dan tidak terlalu cair).
Dalam membuat media kultur jaringan ada beberapa sikap minimal yang harus dikembangkan oleh pelaksana yaitu:
a. Teliti
Dalam membuat media pelaksana harus memiliki sikap teliti dimana sikap teliti ini diterapkan pada saat menghitung komposisi media, menimbang bahan kimia, memipet larutan, mengukur pH media, mengecek media untuk memastikan bahwa media betul-betul steril.
b. Tekun
Dalam membuat media pelaksana harus memiliki sikap tekun dimana sikap tekun ini diterapkan pada saat mengidentifikasi bahan-bahan untuk pembuatan media, mengkondisikan pH media, menuangkan media ke dalam botol kultur, membersihkan peralatan yang telah digunakan, mengecek media untuk memastikan sterilitasnya, menyimpan kembali bahan dan alat yang telah selesai digunakan.
c. Disiplin
Dalam membuat media pelaksana harus memiliki sikap disiplin dimana sikap disiplin ini diterapkan pada saat menerapkan kesehatan dan keselamatan kerja, menerapkan prosedur pengoperasian peralatan, memasak media, mensterilkan media.
D. Aktivitas Pembelajaran
Fasilitator mengarahkan aktifitas kegiatan pembelajaran pada peserta pelatihan melalui beberapa kegiatan berikut ini:
1. Mengamati
· Membaca modul, melihat dan atau mendengarkan tayangan, melihat alat peraga atau benda sesungguhnya yang ada dalam laboratorium.
· Mencatat hasil pengamatan
2. Menanyakan
· Menanyakan hal-hal yang menarik dan atau yang ingin diketahui lebih lanjut tentang hasil pengamatan yang telah dilakukan.
· Melakukan diskusi kelompok,
3. Mencoba
Melakukan kegiatan praktik dengan menggunakan lembar kerja 3 dan 4
4. Menalar
Melakukan analisis dan buat simpulan dg merangkum hasil bacaan tentang tentang konsep kultur jaringan
5. Mengkomunikasikan
Membuat laporan hasil diskusi, hail praktik kemudian presentasikan
LEMBAR KERJA 3
Membuat Larutan Stok
Pendahuluan
Bahan-bahan kimia yang diperlukan dalam pembuatan media kultur dalam jumlah yang sedikit, maka dalam pelaksanaan penimbangan bahan kimia diperlukan tingkat ketelitian dan ketepatan yang tinggi. Untuk menghindari penimbangan bahan kimia yang berulang-ulang setiap kali membuat media kultur maka perlu dibuat larutan stok terlebih dahulu sebelum membuat media kultur tersebit.
Tujuan
Apabila disediakan alat dan bahan yang sesuai peserta diklat dapat membuat larutan stok media kultur jaringan secara teliti dan hati-hati sesuai dengan tahapan-tahapan yang benar.
Bahan dan Alat
1. Bahan-bahan kimia komponen larutan stok A – H
- Stok makro A-E
- Stok mikro
- Stok Fe
- Stok vitamin
2. Aquades
3. Timbangan analitik
4. Hot plate dan stirer
5. Sendok bahan dan spatula
6. Labu takar atau gelas ukur 100 ml, 500 ml, 1000 ml
7. Gelas piala
Keselamatan kerja
Selama melakukan kegiatan ini diharapkan Anda selalu bertindak secara hati-hati, teliti, cermat dan taat azas, hindari kontak langsung (mencium atau memegang) dengan bahan-bahan kimia. Patuhi tatatertip yang berlaku di laboraturium serta mengenakan perlengkapan K3.
Langkah kerja
1. Timbanglah bahan-bahan komponen yang terdapat pada setiap larutan stok dengan menggunakan timbangan analitik sesuai hasil perhitungan di atas
2. Simpanlah hasil setiap penimbangan pada wadah yang berbeda dan diberi identitas sesuai nama bahan
3. Kelompokkanlah bahan-bahan hasil penimbangan tersebut menurut jenis stoknya
4. Buatlah masing-masing larutan stok sebagai berikut:
a. Stok makro NH4NO3
b. Isilah gelas piala ± 500 ml dengan aquades
c. Masukkanlah bahan NH4NO3 kedalam gelas piala
d. Aduk sampai larut merata dengan menggunakan hot plate dan magnetic stirer jangan sampai terdapat endapan
e. Pindahkan larutan ke labu takar 1 liter dan tepatkanlah volume labu sampai tanda tera 1000 ml dengan menambah aquades
f. Berilah label: nama bahan, tanggal pembuatan, konsentrasi stok, dan nama pembuat
g. Stok makro KNO3, KH2PO4, CaCl2.2H2O caranya sama dengan di atas (langkah a-f)
h. Stok mikro
· Masukkanlah satu persatu bahan-bahan stok mikro kedalam gelas piala 1 liter yang berisi ±700 ml aquades, setiap memasukkan bahan diikuti dengan pengadukan agar larut baru diikuti oleh bahan berikutnya
· Setelah semua bahan larut, dipindahkan ke labu takar 1 liter dan ditepatkan volumenya dengan menambah aquades kemudian tutup rapat
i. Stok vitamin
· Semua bahan dimasukkan kedalam labu takar 100 ml yang telah berisi aquades kira-kira 25 ml, hati-hati dalam membilas bahan yang masuk ke labu
· Labu takar dikocok hingga semua bahan larut, kemudian volume labu takar ditepatkan 1 liter dengan menambah aquades dan kemudian tutup rapat.
5. Pindahkanlah larutan stok dari labu takar ke wadah yang sudah disediakan, untuk stok Fe diwadahi pada wadah yang berwarna gelap atau wadah yang ditutupi kertas aluminium foil
6. Berilah identitas/label pada wadah larutan stok yang memuat tentang:
a. nama stok
b. konsentrasi stok (... x Cm, mg/l, ppm, M)
c. tanggal pembuatan
d. nama pembuat
7. Tempatkanlah larutan-larutan stok tersebut pada kulkas
LEMBAR KERJA 4
Membuat Media Kultur Jaringan (MS)
Pendahuluan
Media kultur jaringan tanaman merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan dalam pembiakan tanaman secara kultur jaringan. Oleh karena itu perlu kehati-hatian, ketelitian, ketepatan dan kecermatan dalam bekerja, agar diperoleh media kultur yang memiliki formulasi dan konsentrasi yang tepat.
Berdasarkan kepekatan larutan stok yang telah dibuat di atas maka untuk membuat media MS tidak harus menimbang bahan semuanya tetapi cukup mengambil dari larutan stok yang telah tersedia.
Tujuan
Apabila disediakan alat dan bahan yang sesuai peserta diklat dapat membuat media MS secara teliti dan hati-hati sesuai dengan jenis tanaman yang akan dikulturkan
Bahan dan Alat
1. larutan stok:
2. Komponen media yang lain:
a. gula pasir
b. agar-agar
c. mio-inositol
d. aquades
3. Botol-botol kultur
4. Timbangan
5. Hot plate dengan pengaduk magnet (magnetic stirer)
6. pH meter atau kertas indikator
7. Alat-alat gelas:
- Erlenmeyer, wadah untuk melarutkan dan mencampur bahan, gelas piala, tempat aquades
- Labu takar atau gelas ukur, untuk menepatkan volume larutan
- Pipet tetes dan botol semprot untuk mengambil larutan stok dan membilas pipet yang telah digunakan untuk mengambil bahan/larutan stok yang lainya
Keselamatan kerja
Selama melakukan kegiatan ini diharapkan Anda selalu bertindak secara hati-hati, teliti, cermat dan taat azas serta mengenakan perlengkapan K3.
Langkah kerja
1. Timbang gula 30 g, agar-agar 8 g, mio-inositol 100 mg dengan tepat
2. Larutkan 30 gram gula pasir kedalam ± 700 ml aquades dengan tepat.
3. Tambahkan 20 ml larutan stok A dan 20 ml larutan stok B dengan tepat.
4. Tambahkan 10 ml larutan stok C dan 10 ml larutan stok D dengan tepat.
5. Tambahkan 5 ml larutan stok E dan 5 ml larutan stok F dengan tepat.
6. Tambahkan 1 ml stok vitamin dengan tepat.
7. Tambahkan 100 mg myo-inositol dengan tepat.
8. Tambahkan zat pengatur tumbuh sesuai kebutuhan.
9. Tambahkan aquades hingga volume mendekati 1000 ml dengan tepat, ukur pH media antara 5,6 sd 5,8.
10. Tambahkan ± 8 gram agar-agar.
11. Panaskan sambil diaduk hingga agar-agar larut.
12. Angkat media dari pemanas ketika hampir mendidih.
13. Tuangkan ke dalam botol kultur ± 25 ml.
14. Sterilkan dalam autoclave pada tekanan 17,5 psi selama 30 menit dengan tepat.
E. Latihan Soal
Jawablah soal-soal berikut dengan benar dengan cara memberi tanda silang (X) huruf a,b,c atau d pada salah satu pilihan jawaban!
1. Larutan stok besi (Fe) harus disimpan dalam botol yang gelap karena:
a. bila terkena sinar matahari akan mudah menguap sehingga cepat habis
b. bila terkena sinar matahari akan mudah mengendap sehingga tidak dapat digunakan lagi
c. bila terkena sinar matahari akan mudah ditumbuhi plankton sehingga tidak dapat digunakan lagi
d. bila terkena sinar matahari akan mudah berubah warna sehingga efektifitasnya mudah berkurang
2. Komposisi dan konsentrasi unsur hara pada formulasi media kultur harus tepat baik unsur hara makro maupun unsur hara mikronya. Yang termasuk unsur hara mikro adalah:
a. nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), niasin dan peredoksin
b. boron (B), cobalt (Co), tembaga (Cu), magnesium (Mg), dan sulfur (S).
c. nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg), dan sulfur (S).
d. boron (B), cobalt (Co), tembaga (Cu), Iodium (I), besi(Fe), mangan (Mn), molybdenum (Mo), dan seng (Zn).
3. Media kultur yang telah dibuat jika akan digunakan harus diinkubasikan dulu selama 3-4 hari dengan tujuan ....
a. untuk memastikan bahwa media kultur sudah betul-betul steril
b. untuk memastikan bahwa media kultur sudah memadat dengan baik
c. untuk memastikan bahwa media kultur tidak terjadi perubahan volume
d. untuk memastikan bahwa volume media kultur sudah cukup untuk ditanami
4. Kriteria media kultur yang baik adalah ....
a. tidak ada tanda-tanda terkontaminasi dan tingkat kepadatan agar-agarnya sedang
b. volumenya sekitar 25 ml, sudah betul-betul dingin, dan berwarna bening
c. sudah diinkubasikan selama 3-4 hari dan sudah betul-betul dingin
d. sudah betul-betul dingin dan agar-agarnya sudah memadat
5. Sikap yang harus diterapkan pada saat membuat media kultur jaringan agar keberhasilannya tinggi adalah ....
a. tanggung jawab, tekun, dan kerjasama
b. tanggung jawab, disiplin, dan sabar
c. kerjasama, tanggung jawab, dan sabar
d. teliti, tekun, dan disiplin
F. Rangkuman
Komponen dalam media kultur jaringan meliputi unsur hara makro, unsur mikro, vitamin (vitamin B1) dan Myo-inositol, niasin dan piridoksin (B6), gula (sukrosa), zat pengatur tumbuh, agar-agar, arang aktif, dan air suling (aquades).
Jenis-jenis media kultur jaringan antara lain Murashige dan Skoog (MS), memiliki kisaran pemakaian yang paling luas. Gamborg atau B-5, cocok untuk kultur suspensi sel kedelai dan legume. Vacin dan Went (VW), cocok digunakan untuk media kultur jaringan anggrek. Nitsch dan Nitsch, cocok digunakan untuk media kultur tepung sari dan kultur sel. Schenk dan Hildebrandt (SH) cocok digunakan untuk media tanaman dikotil. Woody Plant Medium (WPM) cocok digunakan untuk media tanaman berkayu.
Larutan stok adalah larutan yang berisi satu atau lebih komponen media yang konsentrasinya lebih tinggi daripada konsentrasi komponen tersebut dalam formulasi media yang akan dibuat. Larutan stok dapat dibuat dengan konsentrasi 10 kali hingga 100 kali lipat lebih pekat. Pembuatan media dapat dilakukan dengan cara mengambil sejumlah larutan stok sehingga konsentrasinya sesuai dengan yang terdapat dalam formulasi media yang dikehendaki.
Pembuatan larutan stok juga harus mempertimbangkan kebutuhan media dan masa kadaluwarsa larutan stok. Misalnya masa kadaluwarsa stok adalah 1 bulan, sedangkan untuk membuat media dalam 1 bulan menghabiskan stok masing-masing sebanyak 1 liter dengan kelipatan konsentrasi 100x, maka larutan stok yang dibuat dalam 1 bulan masing-masing sebanyak 1 liter dengan konsentrasi 100 x. Dengan demikian larutan stok yang dibuat tidak pernah mubadzir karena kadaluwarsa.
Pertimbanganyang harus diperhatikan dalam membuat larutan stok adalah:
1. Larutan stok sebaiknya disimpan tidak lebih dari dua bulan. Stok vitamin dan ZPT lebih baik kalau digunakan dalam keadaan segar atau kurang dari dua minggu setelah dibuat. Oleh karena itu berapa volume larutan stok yang akan dibuat, sebaiknya ditentukan dahulu berapa kebutuhan media dan kapan media akan dibuat.
2. Larutan stok yang telah mengalami pengendapan dan yang sudah ditumbuhi mikroorganisme tidak boleh digunakan lagi.
3. Semua peralatan gelas untuk membuat stok dan media harus dibilas dengan aquades dulu baik sebelum maupun setelah digunakan.
4. Kebutuhan larutan stok untuk membuat media dapat digunakan rumus V1 x N1 = V2 x N2.
Sebelum media tanam dibuat, sebaiknya beberapa zat komponen media perlu ditimbang seperti agar-agar dan gula serta alat dan bahan yang diperlukan sudah disiapkan. Semua komponen media baik dalam bentuk larutan stok maupun bahan yang ditimbang dimasukkan satu demi satu ke dalam gelas piala, volume akhir dibuat menjadi 1 liter dengan menambahkan aquades, pengukuran dilakukan dengan menggunakan gelas ukur. Larutan diaduk sampai homogen kemudian pHnya diukur, apabila pHnya lebih tinggi dari pH yang diinginkan larutan ditetesi dengan HCl sedangkan apabila lebih rendah ditetesi KOH. Setelah pH larutan diukur, pemadat media (agar-agar 7 g/l atau gelrite 2 g/l) ditambahkan, media dimasak sampai mendidih untuk melarutkan pemadat medianya. Media dimasukkan ke dalam botol-botol kultur dan ditutup dengan plastik atau aluminum foil, media dalam botol disterilisasi menggunakan autoklaf pada tekanan 1,1-1,5 kg/cm2 dengan suhu 121°C selama 20 menit. Setelah dingin, media sebaiknya disimpan di ruang ber-AC (suhu24-26°C) selama 3 hari sebelum digunakan dengan tujuan untuk melihat kesterilan media yang ditandai dengan tidak adanya kontaminasi dalam media tersebut.
Kriteria media tanam yang baik untuk ditanami adalah:
1. Tidak terjadi kontaminasi setelah diinkubasikan selama 4 sd 5 hari
2. Kepadatan agarnya cukup/ sedang (tidak terlalu keras dan tidak terlalu encer
Komentar
Posting Komentar